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雙縮脲法測定蛋白質濃度 實驗報告
體積cu是什麼單位
實驗五 雙縮脲法測定蛋白質濃度
一、
實驗目的
1、學習蛋白質濃度測定的方法和原理。
2、掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的方法。
二、實驗原理
1、微量凱氏定氮法
①天然有機物(蛋白質和氨基酸的化合物)的總氮量通常用此方法測定。
②原理:被測的天然含氮化合物與濃硫酸供熱時分解出氨。氨與硫酸反應生成硫酸銨,在凱氏定氮儀中加入強鹼消化液,使硫酸氨分解出氨。用水蒸氣蒸餾法將氨蒸入無機酸溶液中,然後再用標準酸溶液進行滴定,滴定所用無機酸的量(mol)相當於被測樣品中氨的量(mol)。根據所測得的氨量即可計算樣品的含氮量。
③因為蛋白質含氮量通常在16%左右,所以將凱式定氮法測得的含氮量乘上係數0。25,得到該樣品的蛋白質含量。
2、
雙縮脲法
①
原理:當脲加熱至
180度時,兩分子脲縮和,放出一分子氨而形成雙縮脲。在鹼性條件下能與硫酸銅生成紫紅色絡合物,即發生雙縮脲反應。蛋白質分子中含有肽鍵,與雙縮脲結構相似,故蛋白質與鹼性硫酸銅也能形成紫紅色絡合物,在一定條件下,其顏色深淺與蛋白質濃度成正比,可用來進行蛋白質定量,最大波長位於540 nm處,本法測定蛋白質範圍為1~10mg。
3、
Folin-酚
試劑法
①Folin-酚反應是在雙縮脲反應的基礎上引進Folin試劑(磷鉬酸-磷鎢酸試劑),蛋白質-銅絡合物能還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑,生成藍色物質。在一定條件下,藍色強度與蛋白質的量成正比例。
②這個方法的優點是操作簡便,靈敏度高(20-250μg),較紫外吸收法靈敏10-20倍,較雙縮脲法靈敏100倍,其不足之處是此反應受多種因素干擾。
4、
紫外分光光度法
①由於蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,因此蛋白質具有吸收紫外線的性質,吸收高峰在280nm波長處。在此波長範圍內,蛋白質溶液的光吸收值(OD
280
)
與其含量成正比關係,可用作定量測定。
②利用紫外吸收法測定蛋白質含量的優點是迅速,簡便,不消損樣品。低濃度鹽類不干擾測定。
5、
總蛋白定量分析法
-BCA法
①原理:鹼性條件下,蛋白質將Cu
2+
還原為
Cu
+
,
Cu
+
與試劑形成紫色的絡合物,測定其在
562 nm處的吸收值,並與標準曲線對比,即可計算出待測蛋白的濃度。
②特點:準確靈敏,快速,經濟實用,不受樣品中離子型和非離子型去汙劑影響,檢測不同蛋白質分子的變異係數小於考馬斯亮藍。
三、試劑和儀器
1、試劑
蒸餾水、雙縮脲試劑、
2mg/ml牛血清白蛋白、待測蛋白
2、儀器
電熱恆溫水浴鍋
四、
實驗步驟及注意事項
1、
取
15個試管。按1~6編號、加試劑(做兩個平行組)。
2、
每支試管混勻後加入雙縮脲試劑
3。0ml,37℃反應30分鐘。
3、
以零號試管調零,測定各個試管
540 nm光吸收值。
4、
注意事項
①每個試管由顯色到比色時間應儘可能一致。
②樣品蛋白質含量應在標準曲線範圍內。
五、
資料處理
1、
繪製標準曲線。
你牛血清白蛋白含量為橫座標
OD
540
為縱座標,繪製標準曲線。
2、
樣品的計算
根據樣品的
OD
540
從標準曲線上查得樣品的蛋白質含量
(
mg)
。
再
根據樣品的體積計算出樣品的濃度。
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