科研達人 | 為什麼我的 western blot 結果不理想?

如期而至

Western blot 的福利！小編經過不懈努力終於整理好了上半段。話不多說，直接開嗑。

瞭解原理是為了更好的實踐操作。Western blot 基本原理是透過

特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色

。

透過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的資訊。

操作流程

1、聚丙烯醯胺凝膠電泳

（1）基本原理：蛋白質在聚丙烯醯胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決於

它所帶淨電荷以及分子的大小和形狀

等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決於

分子的大小

，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由於十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質-SDS複合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而

掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別

，SDS與蛋白質結合後，還可引起構象改變，蛋白質-SDS複合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS複合物的短軸長度都一樣，約為18A（1A=10的負十次方米），這樣的蛋白質-SDS複合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決於分子量的大小。由於蛋白質-SDS複合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠後，由於聚丙烯醯胺的分子篩作用，

小分子的蛋白質可以容易的透過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯後

，

這樣蛋白質在電泳過程中就會根據其各自分子量的大小而被分離。

制膠

（2）注意事項：影響跑膠跑的質量，有以下兩個原因：1、

電壓

，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮。2、

膠的均勻度

，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要乾淨，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。加入分離膠後，

立即覆一層雙蒸水的目的

：一是為了使分離膠介面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質分子跑時在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。

（3）常見問題：

1）“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶？主要是由於凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現於較厚的凝膠中。

處理辦法

：待其充分凝固再作後續實驗。

2）“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶？主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除乾淨。

處理辦法

：可在兩板間加入適量緩衝液，以排除氣泡。

3）出現拖尾現象？主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。此外可能是灌膠時分離膠過多導致濃縮膠很少，不能起到濃縮作用，沒有把樣品壓成一條線。

處理辦法

：加樣前離心；或選擇適當的樣品緩衝液，加適量樣品促溶劑；或是電泳緩衝液時間過長，需重新配製；或降低凝膠濃度和灌膠時分離膠不要過多。

4）出現紋理現象？主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法

：加樣前離心；或加適量樣品促溶劑。

5）“鬼帶”，如何處理？“鬼帶”就是在跑大分子構象複雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉澱，主要由於還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新摺疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。

處理辦法

：在加熱煮沸後，再新增適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

6）溴酚藍不能起到指示作用？在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩衝液和分離膠的濃度有關。

處理辦法

：更換正確pH值的Buffer；或降低分離膠的濃度。

7）電泳的條帶很粗？電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

處理辦法

：適當增加濃縮膠的長度和適當降低電壓。

8）電泳電壓很高而電流卻很低呢？主要是由於電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a。內外槽裝反；b。外槽液過少；c。電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

9）凝膠時間不對，或慢或快？通常膠在

30min-1h

內凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應該現配現用，TEMED不穩定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。

10）電泳時間比正常要長？可能由於

凝膠緩衝系統和電級緩衝系統地PH選擇錯誤

，即緩衝系統地PH和被分離物質的等電點差別太小，或緩衝系統的離子強度太高。

轉膜夾板

2、

轉膜

（1）基本原理：一般採用

“

濾紙-凝膠-膜-濾紙”

夾心法，凝膠靠近負極，膜靠近正極。因為蛋白上結合有SDS，因而帶負電，

在電流的作用下會從負極向正極運動

，從而轉移到膜上。

（2）注意事項：轉膜之前將海綿、膠、膜都用

預冷

的轉移buffer浸泡

20min

。凝膠若是沒在預冷的轉膜buffer中浸泡，就會在轉膜過程中出現凝膠皺縮，導致出現轉移條帶變形。PVDF膜具有疏水性，需用

甲醇浸泡

。轉膜順序：

陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

。避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。

因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率並會使膜髒掉

。

夾好膜和凝膠後，確定在

凝膠、膜和濾紙之間沒有氣泡

存在，否則會導致轉膜不完全。

（3）常見問題：

1）

轉膜後經麗春紅染色的條帶，大蛋白分子的一端的轉膜效果不好？大分子的蛋白轉移的慢，可以延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。

2）膜、濾紙、膠大小？濾紙≥膜≥膠。

3、

封閉

（1）基本原理：做western時轉膜一般都用PVDF膜，經甲醇活化後PVDF膜跟蛋白質結合的能力很強，因為一抗二抗都是蛋白質，

若不封閉，一抗二抗就會結合在膜上，會引起很高的背景

。最常見的封閉劑是BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20，緩衝溶液是TBS或PBS。

（2）注意事項：

在轉移

結束前

配好5%的Milk。轉移結束後將膜放入milk中block（一定要放在

乾淨的容器

裡

，避免汙染而且要足以覆蓋膜），並清洗整理好用過的濾紙，以便

下次使用

。

4、一抗孵育

（1）基本原理：

一抗透過

抗原-抗體

反應與目的蛋白結合。

（2）注意事項：根據說明書按照適當比例使用TBST稀釋一抗，然後將膜轉移到含有一抗的管中，4℃孵育過夜或室溫（22-25℃）搖動孵育2h。（一抗可回收，2-3天內使用，但

僅限於是在4℃孵育過夜的

，如果是在室溫下的，一抗則不能重複利用。）一抗孵育結束後，用TBST在搖床上洗6次，每次5min，去除殘留一抗。

這周小編先介紹到這裡，欲知後續如何，且聽下回分解。下週四，科研達人 | 醫學科研常用實驗技術——免疫印跡試驗（下），我們不見不散。

部分資訊來源網路

編輯、排版：黃偉