國科風教你單細胞測序（12）：分析流程（五）

大家好！我是國科東方綠豪克，我是生命科學方向的博士。

進行完單細胞資料標準化後，就要進行後續的降維（Dimensionality Reduction）和細胞亞群的鑑定等後續分析。但在進行這些後續分析前，還需要進行 scRNA-seq 資料的 imputation（Imputation of ScRNA-seq Data）。

那麼為什麼要進行單細胞資料的 imputation 呢？這其中主要與 Dropouts 有關，因為在單細胞 RNA-seq 實驗過程中，會產生因原始 RNA 擴增失敗而導致的缺失值（droputs）。

前面的內容已經講過，dropouts 主要跟實驗選擇的方案有關，也與每個細胞測序的 reads 量相關。因為實驗過程中產生的 dropouts，導致後續分析中增加了細胞間的變異。同時對每個基因而言，導致基因表達分析失去真實性，也對基因間調控網路的分析存在誤差。這些無法檢測到 dropouts，對後續的分析將有很大的影響，因此需要採用一些演算法來進行 imputation，從而保證下游分析的正確性。

下面我給大家介紹集中 imputation 的方法，imputation 是一種用替代值替換缺失資料的有效方法。

1。 SAVER：

該方法透過表達恢復進行單細胞分析，該方法基於貝葉斯模型，借用跨基因和細胞的資訊來插補零值並改善所有基因的表達（如使用質量控制後的具有 UMI 計數的 scRNA-seq 資料）。

使用 SAVER 後，利用 Seurat 對參考、觀察和恢復的資料集進行細胞聚類，SAVER 的聚類準確性要明顯高於 MAGIC 和 Sclmpute（這兩種方法後面會介紹）。同時對小鼠視覺皮層細胞資料進行分析，利用 SAVER 進行 imputation 後，可以清晰地區分各種亞型細胞類群，而未進行SAVER的資料，則幾乎無法區分亞型。

2。 MAGIC：

MAGIC（Markov affinity-based graph imputation of cells）方法基於馬爾可夫親和力的細胞圖插補法，透過資料擴散的方式在相似細胞間共享資訊。

下圖為 MAGIC 的插補流程，利用 MAGIC 方法可以恢復資料中較精確的表型結構，使後續的發育軌跡和聚類都可以有很好的結果。同時，該方法還在不同的生物系統和測量技術中得以驗證，表明 MAGIC 是進行資料 imputation 良好的工具。

3。 Sclmpute：

Sclmpute 相比 SAVER 和 MAGIC，可以在不引入新的偏差的情況下計算 dropout 值。該方法考慮到 SAVER 和 MAGIC 可能將細胞中未受 dropout 影響的基因進行恢復，所以 sclmpute 利用混合模型來定位可能的缺失值，之後對其進行插補。具體的原理如下圖所示：

利用模擬資料進行評比，Sclmpute 較 MAGIC 和 SAVER，在進行完 imputation 後，細胞類群的分析結果更好。

同時，在 PBMC 資料集中利用 Sclmpute 進行 imputation 後，細胞亞群的分析結果有較為明顯的提升，也表明該方法具有很好的 imputation 效果。