如何進行外泌體鑑定？（一）

外泌體參與神經疾病和癌症等很多種疾病的病理過程，同時在正常的生理過程中也發揮著介導細胞間通訊的重要功能。細胞外囊泡在臨床醫學中也有十分光明的應用前景，由於它們含有豐富的生物標誌物，可用於監測疾病進展，治療反應等，同時由於外泌體具有攜帶遞送生物分子的功能，具有成為臨床藥物遞送載體的潛力。外泌體的功能研究第一步，即進行外泌體的鑑定。

什麼是外泌體？

外泌體是由細胞分泌的直徑在

30~150nm的膜性小囊泡，那麼是否存在直徑大於150nm或與外泌體大小相近的其它膜性小囊泡呢？答案是肯定的。這裡就要說到細胞外囊泡（EVs），EVs是由細胞釋放的膜性小囊泡，直徑在30nm到9μm之間，根據直徑的大小，可細分為三大類：外泌體（30~150nm）、微囊泡（100-1000nm）和凋亡小體（50-2000nm）。

國際細胞外囊泡學會（

ISEV）在2014年提議，對於分離獲得的外泌體需要從三個層面進行鑑定：（1）Western Blot（WB）鑑定外泌體表面標誌物；（2）透射電鏡（TEM）鑑定外泌體形態；（3）粒徑分析（NTA）鑑定外泌體大小。

如何進行外泌體鑑定

WB驗證：檢測外泌體標誌蛋白的表達情況

鑑定外泌體首先需要透過

WB來鑑定外泌體的標誌蛋白是否存在於樣品中，外泌體形成於早期胞內體，在內吞體轉運複合體（ESCRT）及一些相關蛋白的調控下，早期胞內體發生內出芽形成多個腔內小囊泡，構成多胞體（MVB），MVB 最後在GTPase家族中的RAB酶調解下與細胞膜融合向外界釋放囊泡。

外泌體膜上富含參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族（

CD63、CD81和CD9））、熱休克蛋白家族（（HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90）以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結腸上皮細胞來源）、MHC-II（抗原提呈細胞來源）、CD86（抗原提呈細胞來源）以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的細胞外囊泡標誌物。

這些標誌物蛋白其實主要是涉及到了囊泡的形成和分泌過程，他們產生於細胞中，定位於胞內的膜結構附近，如四旋蛋白（

CD9，CD63和CD81），直接參與了細胞外囊泡內容物的分選；TSG101是ESCRT複合體相關的蛋白，而ESCRT複合體是膜形成和斷裂的驅動器。ALIX直接涉及到了膜泡在形成過程中切割脫離質膜形成獨立膜結構的過程。

電鏡：分析外泌體的大小

/形態等

掃描電鏡

（scanning electron microscopy， SEM）或透射電鏡（transmission electron microscopy， TEM）等電子顯微鏡可用於外泌體鑑定。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質相互作用所產生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結構和形貌的高解析度資訊。由於超高真空技術的發展，場發射電子槍的應用得到普及，現代先進的SEM的解析度已經達到1 nm左右，足夠用來進

行外泌體尺寸的測量。

TEM是把經加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦後在成像器件（如熒光屏、膠片、感光耦合元件）上顯示出來。

操作步驟大致是：

用

PBS重懸提取的外泌體，滴於孔徑2 nm的載樣銅網上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網側邊吸乾液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負染5 min，濾紙吸乾負染液，室溫晾乾，電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結構（也會有200 nm以下、較難鑑別的其他形狀的外泌體），但電鏡對樣品的預處理和製備要求較高，樣品分離方法和樣品性質可能影響電鏡結果的好壞；樣品的準備階段比較複雜，不適合對外泌體進行大量快速的測量；且因外泌體經過了預處理和製備過程，無法準確測量。

以上兩種方法是最常用的外泌體的鑑定方法，是展開外泌體功能研究的前提。比如在腫瘤研究中，透過提取鑑定不同細胞系中的外泌體，進而透過

PCR以及測序篩選分析RNA，探究外泌體在腫瘤進展或者耐藥中的發生機制。

作者：海星生物

公眾號：海星生物科技

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