揭示能夠提高Cas9基因編輯和鹼基編輯特異性的選擇性核輸出抑制劑

CRISPR基因編輯

CRISPR基因編輯是一項“年輕”的技術，但在疾病治療中已經展示出廣泛的應用潛力。在臨床方案中，CRISPR-Cas9往往為組成型表達，容易導致Cas9核酸酶過度積累，最終增加其脫靶效應的機率。在更為精確的基因編輯工具中，如：鹼基編輯（包括胞嘧啶鹼基編輯CBE和腺嘌呤鹼基編輯ABE）和先導編輯，類似問題依然存在。為此，研究人員試圖探討CRISPR抑制劑的應用對Cas9基因編輯和鹼基編輯效能提升的可行性。

研究發現，

一系列CRISPR抑制劑，如：抗CRISPR蛋白Acr，寡核苷酸和噬菌體多肽，能夠透過可逆的、非共價的形式來干擾CRISPR-Cas9的作用過程。

儘管

CRISPR-Cas

抑制劑種類繁多，這些抑制劑的作用機制以及治療前景仍然尚未明確。

Cartoon illustrating SINE-mediated modulation of Cas9 mRNA transport

研究內容

近日，來自上海科技大學的劉佳團隊揭示了

一系列能夠提高

Cas9

基因編輯和鹼基編輯特異性的選擇性核輸出抑制劑

（SINE）

。

有趣的是，

SINE

並不是直接靶向抑制

Cas9

，而是透過干擾

Cas9 mRNA

的核輸出過程來調節

Cas9

的作用效果。

在人源細胞中，該團隊成功驗證了這些

SINE

能夠提高

CRISPR-Cas9

基因編輯、鹼基編輯和先導編輯的精準度。

該研究結果發表在國際期刊

《Communications Biology》

上，題目為

KPT330 improves Cas9 precision genome- and base-editing by selectively regulating mRNA nuclear export。

篩選不可逆的CRISPR-Cas9小分子抑制劑

在攜帶“out-of-frame” EGFP報告基因的HEK293細胞中，作者加入各種候選化合物並透過細胞能否發出熒光來判別該化合物是否具有CRISPR-Cas9抑制性。

一般情況下，

CRISPR-Cas9

靶向“

out-of-frame” EGFP

序列後能夠使

EGFP

啟用。一旦發現抑制劑，上述過程將會被阻斷，

EGFP

表達受阻，細胞不會發出綠色熒光。首輪篩選發現了

多個

攜帶邁克爾受體的化合物對

CRISPR-Cas9

顯示出抑制性。

以此為基礎，作者對含類似結構的已上市或處於研究階段的化合物進行二輪篩選，發現一系列

具有

CRISPR-Cas9

抑制性的

KPT

化合物（含

FDA

批准的抗癌藥

KPT330

）。

Identification of SINEs as CRISPR-Cas9 inhibitors

SINE

透過

XPO1/HuR

或

XPO1/LRPPRC

通路來調節

Cas9 mRNA

的核輸出

定量分析結果顯示，

KPT

化合物呈劑量依賴性地減少細胞質

Cas9 mRNA

對總

Cas9 mRNA

的佔比，這意味著

這些化合物主要調控

Cas9 mRNA

的胞內運輸而不是轉錄過程。

作者推測這些

SINE

的靶點為

XPO1

，一種負責調控核蛋白和

RNA

胞內運輸的轉運蛋白。

後續研究提示，

KPT330

與

XPO1

相互作用誘導蛋白酶體介導的蛋白質降解過程，在

siRNA

對

XPO1

的沉默作用的基礎上進一步封鎖

XPO1

對

Cas9 mRNA

的核輸出。

儘管

KPT330

需要透過

XPO1

下游的銜接蛋白

HuR

或

LRPPRC

來調節

Cas9 mRNA

的核輸出，但不會直接作用於這些蛋白。

SINEs inhibit the nuclear export of Cas9 mRNA in an XPO1-dependent manner

SINE提升Cas9介導基因編輯的特異性

透過

CRISPR-Cas9

靶向編輯與非靶向編輯之間的比率，可以看到

各種

SINE

明顯改善了

CRISPR-Cas9

編輯

HBB

和

RUNX1

基因位點的特異性。

在

HeLa

和

HEK293

細胞中，

KPT330

和

KPT8602

均能顯著改善

CRISPR-Cas9

編輯

AAVS1

、

EMX1-2

、

HBB

、

FAT

和

EMX1-3

這些基因位點的特異性。相比之下，

Acr這種已知能夠改善CRISPR-Cas9特異性的化合物無法適用於所有測試的細胞和/或基因位點。

Evaluation of the effects of SINEs on the genome-editing specificity of CRISPR-Cas9

SINE

改善CBE編輯特定區域的效能

最後，作者還探討了各種

SINE

對

Cas9

鹼基編輯和先導編輯效能提升的可行性。儘管

KPT185、KPT330、KPT335

和

KPT8602

對

BE3

或

A3A CBE

的靶向和非靶向編輯過程均顯示出抑制作用，這些

SINE

對

CBE

的非靶向編輯過程的抑制作用更為顯著，有助於規避脫靶效應。

同樣地，

在HEK293T細胞，這些SINE也能抑制多個基因位點的先導編輯過程。

Evaluation of the effects of SINEs on base- and prime-editing tools

總結

總之，該研究首次篩選出一系列

CRISPR-Cas9

間接、不可逆抑制劑。這些抑制劑

（SINE）

包含了

FDA

批准的抗癌藥

KPT330

，主要透過干擾

Cas9 mRNA

的核輸出過程來調節

Cas9

的作用效果，有望用於提高

CRISPR-Cas9

基因編輯、鹼基編輯和先導編輯的精準度。

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END

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