Nat Neurosci系統總結：突觸前的光遺傳學

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近年來，隨著光遺傳學技術的發展，其在神經科學領域的應用越來越廣泛。得益於其對靶向目標的專一性，操縱時間上的快速性和精確性，相比於化學遺傳學等其他的方法，光遺傳學成為操縱突觸前神經遞質釋放的最佳方法。然而，

由於光遺傳學工具多種多樣，在使用前需要了解它們的特性以及它們靶向目標的特性。

Ofer Y

教授團隊據此總結了

光遺傳學工具在突觸前的種類和應用策略

，並將其成果

“Optogenetics at the presynapse”

於2022年7月發表於

Nature Neuroscience

雜誌。

光遺傳學工具的生物物理特性

目前使用的光遺傳學工具主要分為三類：

光遺傳學工具的生物物理特性

（BLRs）以及

光遺傳學工具的生物物理特性

。視紫紅質包含了一個7個螺旋的膜蛋白（視蛋白），視黃醛髮色團鑲嵌其中並與視蛋白共價結合，光刺激後視黃醛會出現構象改變，從而改變其狀態。

視紫紅質分為I類（微生物型）視紫紅質和II類（動物型）視紫紅質，其中I類又分為光敏通道蛋白（ChRs，被動轉運的離子通道），光碟機動的離子泵（主動轉運）以及酶視紫紅質，II類則是特異性被光啟用的G蛋白偶聯受體（GPCRs），也可以分為視覺型視紫紅質（視感蛋白、視錐蛋白）和非視覺型視紫紅質。

BLRs使用黃素作為髮色團，有黃素單核苷酸（FMN），黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）以及核黃素，

光遺傳學工具的生物物理特性

。BLRs可以分為光-氧-電壓域（LOV）、藍光感測器利用FAD域（BLUF）以及隱花色素（CRYs）。

遺傳編碼的光敏劑都源於擬南芥向光素2的綠色熒光蛋白或者LOV2區域，照射後，會產生活性氧，單線態氧會氧化多種氨基酸側鏈，從而在20-150nm光下使相應的蛋白質失活（原位髮色團輔助光失活（CALI））。

圖1。光遺傳致動器概述

光遺傳學工具的生物物理特性

由於大部分的光遺傳學工具都源自於種系發生很遠的物種，在哺乳動物細胞中缺乏定位訊號，因此經常會導致光遺傳學工具無效的膜定位，細胞內聚集以及高濃度時的細胞毒性。

目前沒有通用訊號序列用於靶向光遺傳學工具於軸突和突觸前，但是有兩種機制可以促進軸突定位：一是透過

視紫紅質、藍光受體

，二是透過

光敏劑

，例如將光遺傳學工具融合到突觸素中，可以促進它在突觸前細胞質或者突觸囊泡腔的表達升高（圖2）。

圖2。光遺傳致動器的軸突運輸和突觸前靶定

BLRs可以控制多個效應蛋白，在光消失之後，也會存在殘留的暗活性，無法做到精準的時間控制，主要應用在植物和細菌中

光敏通道輔助的環路對映（CRACM）主要促進突觸前釋放，其策略是將陽離子型ChR（CCR）表達於突觸前，之後光照射目標區域，導致

靶向光遺傳學驅動器於軸突和突觸前

，從而產生動作電位（AP），之後AP引起鈣離子內流，從而導致突觸前釋放，同時檢測突觸後的電流，從而觀測兩者之間的功能連線。

但CRACM也存在問題，即AP產生之後，向下傳導的同時，也會逆向傳導，導致側枝突觸前釋放，使得體內CRACM實驗結果變得複雜。在體外腦切片中，可以透過

靶向光遺傳學驅動器於軸突和突觸前

。

在生物中可以透過區域性

靶向光遺傳學驅動器於軸突和突觸前

。相比於電刺激，光刺激突觸前末端會產生更大的突觸後反應，而且不同的實驗流程、不同的通路以及不同的細胞型別，光遺傳學刺激的效果都可能不同（圖3）。

圖3。透過CCR刺激導致的光誘導的神經遞質釋放的概念和缺陷

光遺傳學

胞體樹突部位優先胞吞的單向膜插入

則有3種策略：

其一，透過外向的質子泵（ArchT， Arch3， Jaws）或者內向的氯離子泵（NpHR）使軸突膜超極化從而抑制AP的傳播，降低突觸前鈣離子內流。遞質傳遞的降低在光照瞬間發生，並在照明終止後的幾秒鐘內消失。這種方法適合快速抑制的實驗，因為一旦時間加長（幾分鐘）就會產生其他非預期效應。

其二，透過GPCRs抑制神經遞質釋放，突觸前的GPCRs本身就是天然的突觸前釋放抑制劑，GPCRs有3個不同的亞基，α，β和γ，β和γ亞基可以與電壓門控的鈣離子通道（VGCCs）相互作用從而降低它的開放機率，此外，這兩個亞基可以直接干擾SNARE介導的囊泡與膜融合，抑制突觸前釋放。非視覺型II類視紫紅質與G蛋白偶聯受體偶聯，且不會產生光漂白的現象從而可以成為有效的抑制突觸前釋放的工具（optoGPCRs），目前描述地最多的是來自八目鰻的側視蛋白（LcPPO）以及來自蚊子的OPN3。

其三，由光敏劑介導CALI（InSynC）系統以及AsLOV2衍生的iLID二聚體系可以直接損傷釋放裝置，損傷囊泡釋放相關蛋白從而抑制突觸前釋放。相比上述兩種方式，

特異性囊泡進行的軸突導向的轉運

（圖4）。

圖4。光遺傳學抑制神經遞質釋放的不同原理

相對光遺傳學刺激神經遞質釋放，它抑制釋放的效果更難被確認，因此在實驗設定中需要驗證它的表達和表現（圖5）。

圖5。光遺傳突觸前抑制的驗證

光遺傳學工具在突觸前的應用

軸突膜去極化

同時抑制突觸前鈉離子和鉀離子通道，使光照後目標區域有鈉離子內流的同時不產生AP，並激發鈣離子內流從而釋放神經遞質

Benjamin R， et al。 Optogenetics at the presynapse。

Nature Neuroscience

， 2022。 DOI： 10。1038/s41593-022-01113-6。

注射利多卡因或者特異性阻斷突觸後受體來達到上述效果

抑制神經遞質釋放