雙縮脲法測定蛋白質濃度 實驗報告

實驗五 雙縮脲法測定蛋白質濃度

一、

實驗目的

1、學習蛋白質濃度測定的方法和原理。

2、掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的方法。

二、實驗原理

1、微量凱氏定氮法

①天然有機物（蛋白質和氨基酸的化合物）的總氮量通常用此方法測定。

②原理：被測的天然含氮化合物與濃硫酸供熱時分解出氨。氨與硫酸反應生成硫酸銨，在凱氏定氮儀中加入強鹼消化液，使硫酸氨分解出氨。用水蒸氣蒸餾法將氨蒸入無機酸溶液中，然後再用標準酸溶液進行滴定，滴定所用無機酸的量（mol）相當於被測樣品中氨的量（mol）。根據所測得的氨量即可計算樣品的含氮量。

③因為蛋白質含氮量通常在16%左右，所以將凱式定氮法測得的含氮量乘上係數0。25，得到該樣品的蛋白質含量。

2、

雙縮脲法

①

原理：當脲加熱至

180度時，兩分子脲縮和，放出一分子氨而形成雙縮脲。在鹼性條件下能與硫酸銅生成紫紅色絡合物，即發生雙縮脲反應。蛋白質分子中含有肽鍵，與雙縮脲結構相似，故蛋白質與鹼性硫酸銅也能形成紫紅色絡合物，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，可用來進行蛋白質定量，最大波長位於540 nm處，本法測定蛋白質範圍為1~10mg。

3、

Folin-酚

試劑法

①Folin-酚反應是在雙縮脲反應的基礎上引進Folin試劑（磷鉬酸-磷鎢酸試劑），蛋白質-銅絡合物能還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，生成藍色物質。在一定條件下，藍色強度與蛋白質的量成正比例。

②這個方法的優點是操作簡便，靈敏度高（20-250μg），較紫外吸收法靈敏10-20倍，較雙縮脲法靈敏100倍，其不足之處是此反應受多種因素干擾。

4、

紫外分光光度法

①由於蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，因此蛋白質具有吸收紫外線的性質，吸收高峰在280nm波長處。在此波長範圍內，蛋白質溶液的光吸收值（OD

280

）

與其含量成正比關係，可用作定量測定。

②利用紫外吸收法測定蛋白質含量的優點是迅速，簡便，不消損樣品。低濃度鹽類不干擾測定。

5、

總蛋白定量分析法

-BCA法

①原理：鹼性條件下，蛋白質將Cu

2+

還原為

Cu

+

，

Cu

+

與試劑形成紫色的絡合物，測定其在

562 nm處的吸收值，並與標準曲線對比，即可計算出待測蛋白的濃度。

②特點：準確靈敏，快速，經濟實用，不受樣品中離子型和非離子型去汙劑影響，檢測不同蛋白質分子的變異係數小於考馬斯亮藍。

三、試劑和儀器

1、試劑

蒸餾水、雙縮脲試劑、

2mg/ml牛血清白蛋白、待測蛋白

2、儀器

電熱恆溫水浴鍋

四、

實驗步驟及注意事項

1、

取

15個試管。按1~6編號、加試劑（做兩個平行組）。

2、

每支試管混勻後加入雙縮脲試劑

3。0ml，37℃反應30分鐘。

3、

以零號試管調零，測定各個試管

540 nm光吸收值。

4、

注意事項

①每個試管由顯色到比色時間應儘可能一致。

②樣品蛋白質含量應在標準曲線範圍內。

五、

資料處理

1、

繪製標準曲線。

你牛血清白蛋白含量為橫座標

OD

540

為縱座標，繪製標準曲線。

2、

樣品的計算

根據樣品的

OD

540

從標準曲線上查得樣品的蛋白質含量

（

mg）

。

再

根據樣品的體積計算出樣品的濃度。