【原】條件性基因敲除的“時空開關”-- Cre-loxP系統介紹

基因敲除小鼠是我們研究基因功能必不可少的利器，主要分為全身性基因敲除和條件性基因敲除。然而，全身性基因敲除的小鼠存在著無法忽視的缺陷，例如：不能特異性地研究特定基因在特定組織內（及特定的時間）的功能；全身性基因敲除小鼠有時因某些基因對胚胎髮育的影響而無法正常分娩；或因出生後嚴重的生理缺陷而過早死亡；或不能產生後代而不能獲得純合子動物模型。因此，條件性基因敲除小鼠雖然有周期長、費用高、需要配合特定工具鼠使用等劣勢，但仍獲得了越來越多的選擇與喜愛。

今天，就和大家一起來了解下條件性基因敲除方法必用的Cre-loxP重組系統以及應用Cre-loxP進行條件性基因敲除的原則。

概述

Cre-loxP重組系統，即對一段特定的DNA序列進行定位並用Cre重組酶對其進行剪接，由Cre重組酶和loxP位點兩部分組成。

其中Cre蛋白，最初由“導致重組（Cause recombination）”命名，也有文獻命名為“環化重組酶（Cyclizationrecombinase）”。Cre重組酶（CyclizationRecombination Enzyme）由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，是由343個氨基酸組成的38kD的蛋白質。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能夠特異性識別loxP位點， 從而重組或刪除loxP片段間的基因。

loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌體基因組中34bp的特殊位點序列，包括兩個13bp的反向重複序列和一個8bp的間隔區域。其中，反向重複序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區域決定了loxP位點的方向，間隔區中的“N”代表這個鹼基是可變的：

發展歷史

1985年，R H Hoess， K AbremskiCre-Lox首次發表了大腸桿菌噬菌體P1的Cre-lox位點特異性重組系統的斷裂和交換機制文章。

1987年，Brian Sauer博士把大腸桿菌噬菌體P1的Cre-lox位點特異性重組系統在釀酒酵母中即真核系統中進行了功能表達，提出了Cre介導的位點特異性重組可能是調節真核生物基因組重排的有用工具的預想。

1992年Jamey Marth博士的研究團隊發現了Cre-Lox可以對轉基因動物體內特殊T細胞中由loxP序列所夾的染色體DNA進行高效地刪除，他們由此提出這一技術可以用於確定特定細胞型別中內源基因的功能、標記細胞命運決定中的祖細胞、誘導染色體重組以構建疾病生物學模型、以及確定早期基因損傷對疾病發展的作用。1993年，有研究者報道獲得了具有loxP側位（floxed）DNA聚合酶基因的多能胚胎幹細胞。

結合上述的發展，在1994年，德國科學家K Rajewsky博士實驗室報道了Cre-Lox重組可以用於小鼠T細胞發育中的條件性基因敲除，此後的文獻中重組的效率不斷提高。此後Cre-Lox技術的發展使生物醫學研究中條件性誘變得到廣泛使用，使之成為確定特殊細胞型別和發育階段中基因功能的主流方法。

Cre/loxP系統基因重組原理

當基因記憶體在loxP位點且有Cre重組酶存在時，Cre重組酶便會與loxP位點兩端的反向重複序列區結合形成二聚體。此二聚體與其他loxP位點的二聚體結合，進而形成四聚體。隨之，loxP位點之間的DNA序列被Cre重組酶切掉，切口透過DNA連線酶重新連線。DNA重組結果主要取決於loxP位點的方向及位置，主要存在以下幾種重組方式：

1、兩個loxP位點位於同一條DNA鏈上且方向相反，Cre重組酶誘導loxP間的序列翻轉（Inversion）；

2、兩個loxP位點位於同一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶敲除（Deletion）loxP間的序列；

3、兩個loxP位點位於不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶誘導兩條DNA鏈發生交換（Cassettechange）或染色體易位（Translocation）。

精準地誘導型Cre，調控基因敲除的“時空開關”

Cre工具鼠在Cre 重組酶表達系統上游採用不同組織或細胞特異性的啟動子，就能夠在特定的組織或細胞中表達Cre重組酶，而實現條件性基因敲除的空間特異性。

有了空間上的特異性，那麼條件性基因敲除的時間特異性又是怎麼實現的呢？

答案就是透過誘導型 Cre-loxP 系統來介導時間特異性的基因敲除，透過調控給予誘導劑的時間來人為操控基因敲除發生的時間。那麼誘導型Cre有哪幾種類型？

誘導型Cre分類包括啟動子啟用型和配體誘導型。啟動子啟用型透過誘導劑來調控Cre 重組酶的啟動子活性。例如：四環素誘導型、干擾素誘導型。而配體誘導型主要透過將Cre 重組酶與激素受體配體結合（ligand-bindingdomain，LBD）相融合，形成定位於胞漿的融合蛋白，只有在激素誘導後，融合的Cre蛋白才會發生構象變化從錨定蛋白HSP90上解離下來，進入細胞核，識別loxP位點併發生切割。例如：雌激素誘導型。

下面我們主要來講解下目前最常用的雌激素誘導型Cre。

雌激素誘導型Cre，即CreER系統，也叫他莫昔芬（Tam）誘導的Cre系統。將Cre與雌激素受體ER融合，可透過他莫昔芬（Tam）誘導Cre的重組活性。在沒有他莫昔芬的情況下，CreER融合蛋白與熱休克蛋白90（HSP90）相互作用並存在於細胞質中。在給予他莫昔芬的情況下，他莫昔芬（Tam）作為抗雌激素藥物會與雌激素受體ER結合，從而破壞HSP90與CreER的相互作用，誘導Cre釋放並進行核易位。在細胞核中，CreER識別loxP位點並使相應組織中的基因Y失活。

為了避免內源雌激素的干擾，在雌激素受體ER的配體結合區（LBD）做一個點突變（G521R）就可以使 Cre-ER 只響應外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的誘導，命名為 Cre-ERT。而另一種LBD 突變體融合蛋白被證明對4-OHT 具有遠高於Cre-ERT 的敏感性，這種突變體就是大名鼎鼎的Cre-ERT2。它帶有人ER LBD 中的3 個點突變：C400V/M453A/L544A。CreERT2在體內對藥物誘導的敏感性更高，因此一般優選使用CreERT2。

應用Cre/loxP進行條件性基因敲除的原則

如何應用Cre-loxP系統來獲取特定的條件基因敲除小鼠呢？

首先將loxP序列重組到需要刪除DNA區域兩端，該區域一般被稱為flox區，獲得的小鼠稱為flox小鼠。Flox小鼠基因功能正常，可與在特定細胞或組織或特定時期表達Cre重組酶的Cre工具鼠交配後獲得各種時空特異性基因敲除小鼠。

Flox區的選擇需要考慮如下原則：

1、插入loxP的位置不能影響基因的正常功能。所以，loxP一般插入在exon兩端的intron中或基因外區域，並且需距exon和轉錄起始位點需有一定距離，以免影響mRNA的剪下或啟動子活性；

2、儘量選擇靠前的長度是非3的整數倍的exon。如果無法選擇靠前的非3的倍的exon，也可選擇關鍵功能區域敲除；

3、儘量避免選擇ATG所在的exon，因為存在著蛋白翻譯以靠後隨機的ATG起始得到功能正常蛋白的風險。如果選擇刪除ATG儘量多連帶後續的exon一起刪除；

4、Flox區不應包含其他基因的功能區域，包括啟動子，CDS，UTR等區域；

5、Flox不宜過大，一方面模型製作難度增大，另一方面刪除區域包含其他基因和未知功能區域的機率大大增加。