「星耀小課堂」基操篇｜一文讀懂WB實驗原理及流程

注：本文不構成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準；本文僅作醫療健康相關藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表耀海生物立場。任何文章轉載需得到授權。

前言

WB

，是

Western blotting

的縮寫，即

蛋白質印跡法

，又稱

免疫印跡（immunoblotting）

，也就透過電泳技術分離不同組分，再採用印跡技術將蛋白質轉移（“印”）到特定的膜上，再利用抗原-抗體的特異性結合原理，用抗體作為探針去實現檢測複雜樣品中的靶標蛋白的方法，這項技術也可以用來檢測不同時期蛋白表達的水平以及蛋白相互作用等方面。

在實際操作中，菌菌發現大多數初進實驗室的小白最開始興致勃勃準備大幹一場，但在導師的帶領下簡單操作了一遍WB後，就很容易陷進一個誤區：不需要弄懂WB原理，只用按照SOP做，一樣可以把實驗做成功。可事實真是這樣的嗎？原理真的不會影響到實操嗎？下面菌菌就為你揭秘。

WB由來

1975年，英國人Edwin Mellor Southern發明了基因組DNA特定序列定位的方法：

將待測定DNA分子從瓊脂糖凝膠中轉移

到一定的固相支援物

硝酸纖維素膜（NC膜）

上，即

印跡（blotting）

，然後膜上的核酸與同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下雜交，檢測特定DNA片段，並將這種方法命名為

Southern印跡法

；後來Alwine又用類似方法檢測RNA，正好與DNA相對應，故被稱為

Northern印跡雜交

；1981年Burette成功將

對單向電泳分離後的蛋白質分子轉印

到膜上並進行免疫學分析（如抗體抗原特異性結合），這種印跡分析

稱為

Western印跡法

；而

Eastern blotting

是Western blotting的變形，只是檢測物件變成

了雙向電泳後的蛋白質分子

（所謂的雙向電泳是等電聚焦-聚丙烯醯胺凝膠電泳（IEF-PAGE）分離蛋白質）。

實驗原理

WB實驗是透過

聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）將

混合蛋白質樣品分離後，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至與相對應的第一抗體特異性結合，之後再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終透過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。Western Blotting先使用PAGE（聚丙烯醯胺凝膠電泳）電泳分離出待檢測的蛋白質，再用電場裝置印跡至固相介質（如PVDF膜）上，固相介質以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽型別及生物學活性不變。再以膜上的蛋白質片段作為抗原，與一抗（“探針”）特異性結合起免疫反應，再與酶或同位素標記標記的二抗結合，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

實驗流程

SDS-PAGE凝膠電泳：

（1）分離膠

①配製：

根據蛋白分子量大小確定合適的凝膠濃度後，可參考凝膠配置試劑盒中的說明書（如目標GFP蛋白為25kDa，採用8%-16%梯度濃度的膠），或自行參考文獻配置。依次加入所需試劑於配膠專用燒杯中，輕輕並緩慢吹打膠溶液以混勻，用移液槍吸取液體和打出液體速度應至少保持在2-3s左右。注意：放液時不能全部放出，否則容易產生氣泡，影響實驗結果（有氣泡的地方不導電）；配膠的APS需要在4℃的冰箱中儲存；膠在加APS與TEMED促凝劑前一定要混勻其他組分。

電泳凝膠製備參考濃度

②灌膠：

配10％分離膠，加入TEMED後立即搖勻就可開始灌膠。灌膠時，可用移液槍吸取膠沿玻璃板壁緩緩放出注入膠室，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。再次強調注意控制速度，避免氣泡。然後加入適當劑量的純水或無水乙醇以封膠，以蓋住分離膠為準。

③凝膠：

在室溫下開始凝膠30min。注意：凝膠過程中膠板應當保持穩定，不可晃動，否則導致分離膠液麵不平。

④倒壓膠液：

當壓膠液和分離膠之間有一條折射線時，說明膠已大致凝固。再等大約3min，膠就充分凝固。此時將壓膠液倒入廢液缸，並用吸水紙伸入兩板間的膠室將殘留的壓膠液吸乾，但要注意別碰到分離膠表面。

（2）濃縮膠

①配製：

與分離膠操作一致，只是所需試劑不同。

②灌膠：

配4％的濃縮膠，加入TEMED後立即搖勻灌膠。灌膠操作參考分離膠灌膠。

③插樣品梳：

灌膠後立即將樣品梳緩慢插入凝膠中，樣品梳插入後應與膠板保持平行，不應傾斜。

④凝膠：

大約20min濃縮膠凝固，雙手用食指與拇指捏住梳子，緩慢輕輕豎直向上拔出梳子，切記不要拔歪，保證齒口整齊。

（3）電泳

將膠板放入電泳槽中，並加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩衝液，入足量的樣品和合適的蛋白marker。電泳槽連線電泳儀。上槽接負極，下槽接正極，通電起始電壓80V，10min後100V，電泳2h或當溴酚藍遷移至離底部1cm時，停止電泳。注意不能讓溴酚藍跑出去。

轉膜

轉膜指的是把蛋白從凝膠轉移至特定材質的膜上，我們本次採用PVDF膜，不同膜的性質不同，具體詳情參考表2。

依據膠的大小裁剪膜和濾紙6張，置於緩衝液中平衡10min。PVDF膜則需用純甲醇浸泡溼潤1-2s。採用“溼轉移”，即把“三明治”黑板-海綿-3層濾紙-膠-膜（正面朝下，分清左右，與膠對應）-3層濾紙-海綿-白板依次放好，並完全浸入緩衝液中溼透操作（注意：黑色板的一面對黑色負極，溼轉過程中不能幹，輕輕用刮板趕走氣泡）。

溼轉完成後，夾緊板放入溼轉電轉槽內，在轉膜槽中加滿電轉液，插上電極（100V，1h），開始轉膜。轉膜槽置於有冰袋的泡沫箱中，保證電轉一直處於低溫下進行。轉膜結束後，切斷電源，取出雜交膜。

封閉與孵育

轉膜之後迅速置於Tris-Buffered Saline（TBS）中，於迴旋振盪器上室溫下漂洗5min，以便移除殘留的轉移緩衝液。

隨後將膜用TBST從上向下浸溼後，轉移至含有封閉液（TBST做溶劑，配5%脫脂牛奶）的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉2h或4℃過夜封閉（PVDF膜在甲醇活化後是帶電的，因而在轉膜時會將蛋白吸附，所以封閉的目的就是要將PVDF膜上無蛋白的部分空隙用奶粉填滿，以免孵抗體的時候一抗二抗與之結合，產生非特異條帶或者是背景雜亂）。

一抗：

加入合適稀釋濃度的一抗（用TBST稀釋），室溫，脫色搖床孵育1h；TBST室溫脫色搖床洗3次，每次10min（一抗只能結合能與其特異結合的蛋白，其他沒有結合的就被洗下來了）

二抗：

加入合適稀釋度（用TBST稀釋）的鹼性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗，室溫，脫色搖床孵育1h；TBST室溫脫色搖床洗4次，每次5min（二抗只能結合能與已結合蛋白的一抗結合，其他沒有結合的就被洗下來了）

顯色

辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法：

用微量移液器取等體積的ECL試劑中的A、B發光液放在EP管中恢復至室溫，按比例稀釋混合。

用去離子水稍微漂洗PVDF膜，再用濾紙貼腳吸去膜上殘餘液體，將膜平放，反貼法覆於A、B混合液滴上，避光反應3分鐘，可適當延長；

捨棄ECL混合液置於暗盒中曝光顯影，曝光時間控制在30s左右。

取出膠片立即完全浸入顯影液中 1～2min，清水漂洗一下後放在定影液中至底片完全定影，清水衝淨晾乾，標定Marker，進行分析與掃描。

相信大家看到這裡應該已經弄懂了WB實驗操作的原理和步驟了，其實沒有各位看官想象得那麼簡單，每一個步驟都需要謹慎小心方能得出最後滿意的實驗結果，那實驗結果的分析又會出現什麼波折呢？好了，今天口水已經說幹，且聽菌菌下回分享~