專家點評Science突破丨周斌研究組建立鄰近細胞遺傳操控技術

點評丨楊曉 研究員

（國家蛋白質科學中心·北京）

細胞之間的交流和相互作用是多細胞生物的一項基本特徵，解析細胞之間的相互作用對於深入瞭解多種生物學過程及其調控機制具有重要意義。近30年來，科學家利用現代遺傳學手段，例如遺傳示蹤、組織特異性基因敲除或過表達等技術，研究器官發育、組織再生及疾病發生髮展等過程。但是，當前的遺傳技術基本上是針對特定細胞自身進行細胞或分子水平的操作，

如何深入研究細胞與細胞之間的相互作用依然面臨巨大挑戰

。因此，亟需建立一種新的遺傳操作技術，實現體內監測與記錄細胞之間相互交流並解析相關細胞的功能及其分子調控機制，將極大地推動細胞生物學、遺傳學及再生醫學等領域的發展。

2022年12月2日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）

周斌

團隊在

Science

上發表了題為

Monitoring of cell-cell communication and contact history in mammals

的最新研究成果。

該研究利用人工合成訊號通路結合遺傳學技術，建立了哺乳動物體內鄰近細胞遺傳操控技術，基於該技術揭示了早期胚胎髮育中心臟內皮細胞向肝臟遷移形成肝臟血管的現象，以及描述了腫瘤生長過程中腫瘤血管形成並從內向外遷移的過程。

在該項工作中，研究人員建立了一種檢測細胞之間相互作用的新技術——

gLCCC

（genetic Labelling of Cell-Cell Contact）。基本原理是利用人工改造的Notch訊號通路來操控體內兩個鄰近細胞，在兩個細胞中分別表達人工合成的Notch配體和受體蛋白後，當細胞相互接觸時，配體和受體特異性結合，引起Notch跨膜段的構象改變，接著γ-secretase酶將切斷跨膜段和胞內段的連線，從而釋放胞內段的人工合成遺傳元件，如轉錄調控因子tTA、Cre等，這些遺傳操作元件可以進入到細胞核內從而調控下游基因的表達，這個

人工合成Notch訊號通路—Synthetic Notch

（

SynNotch

） 在體內可以實現將細胞接觸轉變為遺傳資訊。

首先，研究人員以心臟中心肌細胞和內皮細胞為例，將心肌細胞作為SynNotch訊號傳送細胞，內皮細胞作為SynNotch訊號接收細胞，分別構建了心肌細胞特異性表達SynNotch配體的工具小鼠Tnnt2-mGFP，以及內皮細胞特異表達SynNotch受體的工具小鼠Cdh5-GFP抗體-Notch的跨細胞膜段-tTA，簡稱Cdh5-GFP-N-tTA。SynNotch受體蛋白的核心元件有三個部分：GFP奈米抗體（nanobody），它位於細胞膜外，可以與配體GFP結合；Notch的跨細胞膜段，它保留著重要的γ-secretase的酶切位點；以及位於胞內段的遺傳操作元件tTA。在沒有發生細胞接觸時，酶切位點被隱藏在特定蛋白區域內；當細胞相互接觸時，心肌細胞膜表面的GFP和內皮細胞膜表面的GFP抗體特異性結合，透過分子牽拉作用使得SynNotch跨膜段的構象發生變化，暴露出酶切位點，γ-secretase酶將跨膜段切斷，位於胞內段的tTA遊離到胞漿中，進入內皮細胞的細胞核中發揮轉錄調控的作用。為了顯示出最終的轉錄調控結果，研究人員

將tetO-nLacZ作為心肌與內皮細胞相互接觸的報告基因小鼠

，得到Tnnt2-mGFP；Cdh5-GFP-N-tTA；tetO-nLacZ三基因型小鼠。tetO-nLacZ受到tTA調控從而啟用nLacZ表達。當心肌與內皮細胞接觸後，tTA從內皮細胞膜上釋放並進入細胞核，結合tetO轉錄調控序列，啟用nLacZ的表達，透過X-gal染色顯示出與心肌細胞接觸的內皮細胞為藍色，驗證了該系統的可行性。隨後，研究人員進行了系統最佳化，引入了tetO-tdT熒光報告基因小鼠用於檢測細胞之間的接觸，可以更加方便熒光成像和細胞分選。值得注意的是，當兩細胞分開後，SynNotch停止啟用，細胞膜上的tTA將不再入核，同時，遊離的tTA以及報告蛋白會逐漸代謝減少，受體細胞將很快失去報告蛋白標記。因此，

gLCCC反映的是細胞之間的實時接觸資訊。

鄰近細胞遺傳標記技術指示心肌細胞與內皮細胞之間的相互作用

為了讓SynNotch的啟用轉變為永久性的遺傳改變，研究人員引入了Cre-loxP同源重組系統。當Cre-loxP發生同源重組後，兩個loxP之間的序列會被切除，報告基因可以永久性地表達。當受體和配體細胞相互接觸後啟用SynNotch訊號通路，與tetO-nLacZ和tetO-tdT類似，tetO-Cre工具小鼠受到tTA的調控，受體細胞表達Cre，作用於報告基因R26-tdT，從而實現受體細胞的永久示蹤，該技術稱作gTCCC （genetic Tracing of Cell-Cell Contact）。研究人員以心肌細胞作為配體細胞（Tnnt2-mGFP），內皮細胞作為受體細胞（Cdh5-GFP-N-tTA），利用gTCCC研究胚胎髮育過程中這兩類細胞之間的相互作用。從小鼠胚胎E9。5到出生後，心內膜墊逐漸重塑形成心臟瓣膜，如左心室的二尖瓣，此時瓣膜表面的心內膜內皮細胞已經沒有和心肌細胞接觸，瓣膜中由心內膜來源的間充質細胞不僅遠離心肌細胞，而且也不表達Cdh5基因，然而無論是瓣膜的內皮細胞還是間充質細胞都持續表達tdTomato，證明曾經啟用過SynNotch的內皮細胞及其子代細胞都經過Cre-loxP介導的遺傳操作，實現永久性的示蹤標記。此外，研究人員

發現gTCCC示蹤的心臟內皮細胞會在胚胎髮育過程中遷移到肝臟，參與形成肝臟的血管網路。

這部分內皮細胞在肝臟中會持續存在，對於維持肝臟的正常功能可能具有重要作用。gTCCC具備較大的擴充套件性，可以利用Cre-loxP重組進行基因敲除或過表達，實現體內跨細胞遺傳操作，從而改變接觸細胞的表型和命運。

鄰近細胞遺傳示蹤技術追蹤心臟內皮細胞向肝臟遷移

接下來研究人員利用該技術研究了腫瘤血管新生的過程。在腫瘤發生過程中，周圍組織的血管會遷移進入腫瘤，為腫瘤生長提供養料和氧氣。和腫瘤細胞之間的相互作用會使血管內皮發生基因及表型轉變，從而具備一定特性。研究人員利用gTCCC研究腫瘤細胞和血管內皮細胞之間的相互作用。他們在TC-1和LLC腫瘤細胞系中過表達mGFP，皮下注射到受體小鼠Cdh5-GFP-N-tTA；tetO-Cre；R26-tdT中。研究人員發現，腫瘤中幾乎全部的內皮細胞被標記為tdT。而且，伴隨著腫瘤的生長，腫瘤內部的血管可以遷移到腫瘤外包膜組織中。轉錄組測序結果表明，這些曾經與腫瘤細胞相互接觸過的遷移進入腫瘤外包膜中的內皮細胞具有較強的血管新生、細胞黏附、免疫調控、應對VEGF刺激等的特性。因此，gTCCC對腫瘤血管新生和微環境的研究提供了新的遺傳學技術。

鄰近細胞遺傳示蹤技術追蹤腫瘤細胞與血管內皮細胞間的動態相互作用

進一步地，為了拓展鄰近細胞遺傳學的應用範圍，研究人員構建了由Cre重組酶誘導的配體細胞小鼠R26-mGFP，搭配特定細胞型別的Cre小鼠品系，特異性地使該型別細胞表達mGFP，成為配體細胞。同時，研究人員也構建了由Cre重組酶誘導的受體細胞小鼠H11-GFP-N-tTA，透過Cre小鼠使特定型別細胞表達GFP-N-tTA，成為受體細胞。基於以上實驗結果，科研人員更進一步地對系統進行精簡和最佳化，構建了Tigre-synNotch小鼠，將序列tetO-tdT-insulator-CAG-loxP-GFP-N-tTA-pA-loxP-mGFP插入到小鼠基因組Tigre位點。在該小鼠中，所有細胞都會表達GFP-N-tTA可以作為受體細胞。而當搭配特定Cre小鼠時，Cre重組酶會在基因組上切掉GFP-N-tTA-pA序列，使Cre陽性的細胞表達mGFP，成為配體細胞，所有Cre陰性的細胞保持著受體細胞的狀態，因此，能夠利用Tigre-synNotch標記和特定細胞接觸的所有其他細胞。

綜上，

該研究的亮點在於開發了實時監測並遺傳示蹤小鼠體內細胞間相互作用的新技術—gLCCC和gTCCC，以一種全新的細胞譜系追蹤和基因操作技術研究體內鄰近細胞間的相互作用，大大提升對細胞之間交流的研究水平和精度，為深入探求體內細胞命運可塑性提供重要技術手段；此外，利用該技術揭示了在小鼠早期胚胎髮育中心臟內皮細胞遷移到肝臟形成肝臟的血管；描述了腫瘤細胞與血管內皮細胞之間的相互作用，發現腫瘤血管向癌旁組織生長的現象，為腫瘤的基礎研究提供了新的技術支援和研究發現。

鄰近細胞遺傳學技術。（A）小鼠胚胎中心肌細胞表達SynNotch配體（綠色），內皮細胞表達SynNotch受體（紫色）。（B-C）新生小鼠心臟中，表達SynNocth配體的心肌細胞（綠色，B），利用gLCCC標記實時接觸心肌細胞的內皮細胞（藍色，C），利用gTCCC示蹤接觸過心肌細胞的內皮細胞（紅色，D）。

中國科學院分子細胞科學卓越創新中心博士後張少華和副研究員趙歡博士為該論文的共同第一作者，周斌研究員為該論文通訊作者。

專家點評

楊曉

（研究員，國家蛋白質科學中心 （北京））

多細胞生物，特別是哺乳動物的生長髮育和穩態維持是一個非常複雜和高度協調的過程。一方面，細胞內遺傳物質的表達水平決定細胞的分化命運、細胞特異的形態結構和行為特徵。另一方面，多細胞生命依賴於細胞間的協同。各種細胞型別透過細胞間相互作用和細胞間通訊，連線形成多細胞結構，共同協調生物體個體發育和穩態維持。細胞間通訊通常由蛋白質相互作用介導，包括配體-受體、受體-受體和細胞外基質-受體相互作用。接受訊號的細胞透過內源受體觸發下游訊號轉導，導致轉錄因子活性和基因表達改變，調節細胞形態和功能特徵甚至決定細胞的命運轉變。利用遺傳學技術示蹤細胞間通訊將極大地增進我們對從胚胎髮育到腫瘤發生等各種基本生理和病理過程的理解。傳統的遺傳學手段主要針對細胞自身DNA進行操作，比如經典的Cre–LoxP重組技術介導的遺傳譜系示蹤、基因敲除等，但如何有效地示蹤細胞之間的相互作用在技術層面上依然面臨較大的困難和挑戰。

2022年12月2日，中科院分子細胞科學卓越創新中心的

周斌

研究組在Science上發表題為

Monitoring of cell-cell communication and contact history in mammals

的研究論文。在該項工作中，研究人員利用人工合成Notch訊號通路（synNotch）的技術，並結合傳統遺傳學手段，

首次建立了體內鄰近細胞遺傳學技術，更加精準地指徵相互接觸的細胞，並永久地記錄發生過接觸的細胞，實現鄰近細胞命運的示蹤。此項工作的亮點在於建立了一套設計嚴謹、簡易直觀、可調控的鄰近細胞遺傳技術，可以在單細胞水平揭示鄰近細胞的命運及其調控機制。

鄰近細胞遺傳學技術的建立，突破了傳統遺傳學手段只能針對細胞自身的侷限，首次實現了體內跨細胞的遺傳學研究，是領域內一項重大技術突破。

這一研究成果具有廣泛適用性，勢必推動細胞互作相關科學領域的探索。例如，該技術可以用於研究微環境細胞對幹細胞的影響、上皮細胞屏障、免疫細胞的相互作用、神經元接觸、癌細胞之間及其與鄰近免疫細胞之間的通訊等等。此外，干預組織器官不同型別細胞間通訊可能為疾病治療提供全新的策略。

原文連結：

https://doi.org/10.1126/science.abo5503

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